无标记蛋白质组学（Label-Free Quantitative Proteomics）因其样本通量高、操作流程相对简洁、无需昂贵试剂而被广泛应用于疾病机制研究、生物标志物发现和药物作用靶点筛选。然而，随着大规模项目的不断推进，研究者也逐渐意识到——重现性差是制约无标记定量深入应用的核心瓶颈之一。本文将从实验设计、样品处理、质谱采集到数据分析四个关键环节出发，系统解析如何提升无标记蛋白质组学的重现性。

一、无标记定量为何容易“变脸”？

无标记定量方法主要依赖MS1级别的信号强度进行蛋白质定量，与TMT或iTRAQ等基于同位素标签的方法不同，其更容易受到样品批间差异、离子化效率波动、LC-MS系统稳定性等多种因素的干扰。

常见重现性问题包括：

• 不同批次样品定量结果波动大
• 技术重复间蛋白定量标准差高
• 低丰度蛋白检出不稳定

这不仅影响数据的统计显著性，也给生物学解释带来偏差。因此，建立一套系统性的优化策略，是提升无标记蛋白组学可靠性的关键。

二、提升重现性的四大关键环节

1、实验设计：合理控制变量是第一步

在蛋白组学项目中，生物重复与技术重复的设置必须科学严谨。推荐：

• 每组设置≥3个生物重复，确保统计显著性
• 同一批次内完成样本处理和上机，避免跨批次系统误差
• 随机化上机顺序，降低时间漂移影响

此外，对于时间跨度较长的项目，应设立质控参考样品（QC sample），用于监测系统波动与批次间数据归一化。

2、样品处理：标准化流程是重现性的保障

从组织匀浆、蛋白抽提、酶切消化到样品净化，每一步都可能引入变异。建议采取以下措施：

• 使用统一的裂解缓冲液和蛋白定量方法（如BCA）
• 尽量使用自动化液体处理系统减少人工误差
• 固相萃取（SPE）净化步骤建议标准化耗材品牌与流程

3、LC-MS采集：系统稳定是核心基础

无标记定量依赖色谱峰面积，因而对LC-MS系统的稳定性要求极高。

优化策略包括：

• 每日校准仪器，监测保留时间漂移与信号强度
• 使用数据依赖采集（DDA）+动态排除策略，提升谱图覆盖率
• 设置iRT标准肽以校正保留时间波动

4、数据分析：合适的归一化和统计模型是“最后一道防线”

即使在理想实验条件下，少量技术波动仍然不可避免。此时，数据归一化和差异蛋白筛选方法显得尤为关键。

推荐使用：

• MaxQuant、Spectronaut 等成熟平台进行定量与识别
• 基于总离子强度或中位数归一化的方法进行批次矫正
• 差异分析中使用limma、MSstats等带有方差稳定化模型的统计方法

此外，建议进行PCA主成分分析与批次效应评估，对异常样本进行质控剔除。

无标记蛋白质组学虽然存在一定的重现性挑战，但通过从实验设计到数据分析的全流程优化，完全可以实现可靠且具有生物学意义的数据输出。选择具备经验、技术平台完善的合作方，将极大提升研究效率和结果可信度。如您正在开展大规模蛋白组学研究或关注无标记定量的方案优化，欢迎联系百泰派克生物科技，我们将以严谨的科研态度和专业的技术服务，为您的科研项目保驾护航。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

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